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Tipo do documento: Dissertação
Título: Estudos Bioquímicos de proteases extracelulares e expressão de seus genes de isolados de Trichoderma spp. após crescimento em parede celular de Rhizoctonia solani
Autor: Melo, Dayana Rosa de 
Primeiro orientador: Monteiro, Valdirene Neves
Primeiro membro da banca: Monteiro, Valdirene Neves
Segundo membro da banca: Lopes, Flavio Marques
Terceiro membro da banca: Georg, Raphaela de Castro
Resumo: Espécies de Trichodermatem sido estudadas principalmente pelo seu reconhecido papel no controle biológico de diversos fitopatógenos, sendo que proteases, glucanases e quitinases estão intrinsecamente envolvidas nesse processo. Esse trabalho objetivou o estudo bioquímico de proteases extracelulares de Trichodermavirens(301/01), Trichoderma harzianum (494/02 e ALL 42)e Trichoderma asperellum (T00) secretadas quando expostas a parede celular de Rhizoctonia solani (PCRS)e analisada a expressão dos genes de proteases, glucanases e quitinases frente à PCRS tendo como controle a indução em glicose. A atividade especifica de proteases de T harzianum foi baixa em comparação a Tvirens eT asperellum, demonstrando a alta capacidade de micoparasitismo dessa espécie, jáque no confronto em placa de petri todos os isolados foram efetivos contra R. solani. Foi utilizada a Cromatografia de afinidade com bacitracina para obtenção dos extratos de proteases, sendo observados perfis diferenciados para os isolados e para pHs 5,0e 8,0. Foi avaliada a influência de inibidores e detergentes na atividade enzimática no extrato de proteases, PMSF e EDTA inibiram os extratos em aproximadamente 20%, Triton X-100 e SDS inibiram em até 25%. A ação de cátions di e monovalentes foi avaliadarevelando um aumento na atividade enzimática em ate 40% e uma dinimuição de 20% respectivamente. Avaliou-se a afinidade dos extratos de proteases em dois substratos, albumina e azocaseína. A afinidade pela albumina foi baixa em relação a azocazeína para todos os isolados. Em relação a temperatura e pH ótimo verificou-se que os extratos apresentaram temperatura ótima em 50°C e pH ótimo a 8,0. Para avaliar o perfil de proteases dos isolados foi realizada uma cromatografia em gel de poliacrilamida SDS-PAGE. Para avaliar a atividade de proteases em gel de poliacrilamida, ascondiçõesforamnãodesnaturantes (zimograma).A análise da expressão dos genes de proteases foi analisada pela técnica de RT-PCR nos isolados 494/02 e ALL 42 nos tempos de 6, 12, 24 e 48 horas, demonstrando um perfil variando na expressão das proteases trypsin-like, aspartato protease e serino protease. Para analisar a relação da expressão dos genes de proteases e relação à expressão de genes de outras enzimas também envolvidas no micoparasitismo, foi analisada a expressão dos genes de β 1-3 endoglicanase, quitinase 42 kD e N-Acetilglicosaminidase (Nagase) frente a PCRS. O isolado T.harzianum(ALL 42) manteve melhor perfil de expressão de aspartato proteases e de β 1-3 endoglicanase, quitinase 42 kD e N-Acetilglicosaminidase (Nagase). O coeficiente de Pearson foi calculado para correlação entre glucanases, quitinases e proteases, correlações positivas foram observadas para o isolado ALL 42 para aspartato protease e β 1-3 endoglicanase, quitinase 42 kD e N-Acetilglicosaminidase (Nagase), enquanto que 494/02 não demonstrou correlação positiva para aspartato protease.
Abstract: Trichodermaspecies have been studied mainly recognized for its role in biological control of many pathogens, and proteases, glucanases and chitinases are closely involved in this process. This work aimed to study the biochemistry of extracellular proteases from Trichoderma virens (301/01), Trichoderma harzianum (494/02 and ALL 42) and Trichoderma asperellum (T00)secreted when exposed to cell wall of Rhizoctonia solani(PCRS) and analyzed the expression genes of proteases, glucanases and chitinases front PCRS to a control induction into glucose. The specific activity of proteases T harzianumwas low compared to T asperellum and T virens, showing the high capacity of mycoparasitism of this species, since the confrontation in petri dishes all isolates were effective against R. solani. Was used with bacitracin affinity chromatography for obtaining extracts of proteases and different profiles observed for isolates and pH 5.0 and 8.0. The influence of inhibitors and detergents on enzyme activity in the extract of proteases, PMSF and EDTA extracts inhibited by approximately 20%, Triton X-100 and SDS inhibited by 25%. The action of monovalent cations and divalent was evaluated revealing an increase in the enzyme activity by up to 40% and down 20%. We evaluated the affinity of the extracts on two substrates of proteases, albumin, and azocasein. The affinity for albumin was low compared to azocazeína for all isolates. In relation to temperature and pH optima found that the extracts showed optimum temperature at 50 ° C and optimum pH 8.0Toevaluate the profile of the isolated protease was performed on polyacrylamide gel chromatography SDS-PAGE. To evaluate the protease activity polyacrylamide gel electrophoresis, non-denaturing conditions were (zymogram). The analysis of gene expression of proteases was examined by RT-PCR in the isolated 494/02 42 ALL and in intervals of 6, 12, 24 and 48 hours, showing a profile varying in the expression of trypsin-like proteases, aspartate protease and serine protease. To analyze the relationship of gene expression of proteases and to the expression of genes of other enzymes involved in mycoparasitism. Also, we analyzed the gene expression of β 1-3 endoglicanase, 42 kD chitinase and N-acetylglucosaminidase (Nagase) against PCRS . The isolated T. harzianum (ALL 42)maintained higher expression profile aspartate proteases and β 1-3 endoglicanase, 42 kD chitinase and N-acetylglucosaminidase (Nagase). The Pearson coefficient was calculated for correlation between glucanases, chitinases and proteases, positive correlations were observed for isolated ALL 42 to aspartate protease and β 1-3 endoglicanase, 42 kD chitinase and N-acetylglucosaminidase (Nagase), whereas 494/02 showed no positive correlation to aspartate protease.
Palavras-chave: Trichoderma
Estudos bioquimicos
Proteases
Espécies de Trichoderma
Trichoderma species
Área(s) do CNPq: CIENCIAS EXATAS E DA TERRA
CIENCIAS BIOLOGICAS::BIOQUIMICA
CIENCIAS DA SAUDE::FARMACIA
Idioma: por
País: Brasil
Instituição: Universidade Estadual de Goiás
Sigla da instituição: UEG
Departamento: UEG ::Coordenação de Mestrado Ciências Moleculares
Programa: Programa de Pós-Graduação Stricto sensu em Ciências Moleculares
Citação: MELO, D. R. Estudos Bioquímicos de proteases extracelulares e expressão de seus genes de isolados de Trichodermaspp. após crescimento em parede celular de Rhizoctonia solani. 2012. 72 f. Dissertação (Mestrado em Ciências Moleculares) - Câmpus Central - Sede: Anápolis - CET, Universidade Estadual de Goiás, Anápolis-GO.
Tipo de acesso: Acesso Aberto
URI: http://www.bdtd.ueg.br/handle/tede/623
Data de defesa: 1-Sep-2012
Appears in Collections:Mestrado em Ciências Moleculares

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